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PCR引物設(shè)計原則簡介
  • 發(fā)布日期:2016-03-08     信息來源:      瀏覽次數(shù):3059
    • 實(shí)驗(yàn)步驟

      首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ),其次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配) ,再次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計應(yīng)注意如下要點(diǎn):

      1.引物的長度一般為15-30 bp,常用的是18-27 bp。

      2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基,如GGG 或CCC,也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。

      3.引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率,末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3個堿基,因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。

      4.引物序列的GC 含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。

      5.引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度(Tm)。這是當(dāng)50%的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。合理的退火溫度從55℃到70℃。為獲得*結(jié)果,兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。
       

      6.引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。應(yīng)該盡量避免。

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